Калифорнийн Стэнфордын Их Сургуулийн Стэнфордын Их Сургуулийн Анагаах Ухааны Сургуулийн Питер Сарноугийн засварласан, 2020 оны 12-р сарын 25-ны өдөр батлагдсан (2020 оны 10-р сарын 25-нд хянагдсан)
Бид репликаци болон хувьслын хадгалалтад зайлшгүй шаардлагатай коронавирусын транскрипцийн цогцолборуудын хуулбар дахь дэд нэгжүүдийн харилцан үйлчлэлийн талаар мэдээлж байна.Бид nsp12-тай холбоотой NiRAN домэйн нь транс дахь нуклеозид монофосфат (NMP) трансферазын идэвхжилтэй болохыг нотлох баримтаар хангаж, nsp9 (РНХ холбогч уураг)-ыг зорилтот болгон тодорхойлсон.NiRAN нь Mn2+ ионууд болон зэргэлдээ хадгалагдсан Asn үлдэгдэлд тулгуурласан урвалд NMP-ийн хэсгийн хадгалагдсан nsp9 амин төгсгөлд ковалент холболтыг хурдасгадаг.NiRAN идэвхжил ба nsp9 NMPylation нь коронавирусын хуулбарлахад зайлшгүй шаардлагатай болох нь тогтоогдсон.Өгөгдөл нь үүрлэсэн вирусын ферментийн маркерын энэхүү үйл ажиллагааг РНХ вирусын ангилалд РНХ-ийн синтезийг эхлүүлэх нь функциональ болон хувьслын хувьд нийцтэй гэсэн таамаглал дахь өмнөх ажиглалтуудтай холбох боломжийг бидэнд олгодог.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae болон бусад 12 гэр бүл)-ийн РНХ-аас хамааралтай РНХ полимераза (RdRps) нь NiRAN гэж нэрлэгддэг полипротейнээс ялгардаг бүтцийн бус уураг (nsp) дахь амин терминал (N-терминал) домэйнтэй холбогддог. 1ab нь вирусын үндсэн протеазаас (Mpro) бүрдэнэ.Өмнө нь артерийн вирусын NiRAN-RdRp nsp-ийн өөрийн GMPylation/UMPylation идэвхжилийг мэдээлсэн бөгөөд нуклеозидын монофосфатыг (NMP) вирус (одоогоор тодорхойгүй) болон/эсвэл эсийн биополимержих зүйлс рүү шилжүүлэх түр зуурын процесс үүсгэхийг санал болгосон.Энд бид коронавирус (Хүний Коронавирус [HCoV]-229E ба Амьсгалын замын цочмог цочмог хам шинж Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) нь Mn2+-аас хамааралтай NMPylation идэвхжилтэй болохыг харуулж байна. N-терминал хажуугийн nsps нь протеолитик байдлаар ялгарч, фосфорамидат нь nsp9-ийн N-терминал дээр анхдагч аминд (N3825) холбогддог.Уридин трифосфат нь энэ урвалд илүүд үздэг нуклеотид боловч аденозин трифосфат, гуанозин трифосфат, цитидин трифосфат зэрэг нь тохиромжтой субстрат юм.Коронавирусын рекомбинант nsp9 ба nsp12 уураг, генетикийн инженерчлэгдсэн HCoV-229E мутантуудыг ашиглан мутацийн судалгаагаар эсийн өсгөвөрт NiRAN-ийн nsp9 NMPylation болон вирусын хуулбарлахад шаардлагатай үлдэгдлийг тодорхойлсон.Өгөгдөл нь NiRAN идэвхтэй сайтын үлдэгдлийн таамаглалыг баталж, nsp9 N3826 үлдэгдлийн nsp9 NMPylation болон in vitro вирусын хуулбарлахад чухал үүргийг тодорхойлсон.Энэ үлдэгдэл нь N-терминал NNE трипептидийн хадгалагдсан дарааллын нэг хэсэг бөгөөд коронавирусын гэр бүл дэх nsp9 болон түүний гомологуудын цорын ганц инвариант үлдэгдэл болох нь батлагдсан.Энэхүү судалгаа нь бусад үүрлэсэн вирүсийн NMPylation үйл ажиллагааг функциональ судлах бат бөх суурийг бүрдүүлж, вирусын эсрэг эмийг хөгжүүлэх боломжит зорилтуудыг санал болгож байна.
Nidovirales эерэг судалтай РНХ вирус нь төрөл бүрийн сээр нуруутан, сээр нуруугүй амьтдыг халдварладаг (1, 2).Уг захиалгад одоогоор 14 гэр бүл (3) багтаж байгаа бөгөөд үүнээс сүүлийн 20 жилийн хугацаанд коронавирусын гэр бүлийг сайтар судалжээ.Тухайн үед амьтны гаралтай гурван зоонозын коронавирус гарч, хүний амьсгалын замын хүнд халдварын томоохон дэгдэлт үүсгэсэн.Хүнд хэлбэрийн цочмог халдварт өвчнөөс үүдэлтэй байнгын тахал зэрэг орно.Амьсгалын замын хам шинж Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Нидовирусууд нь нийтлэг геномын зохион байгуулалтыг хуваалцдаг бөгөөд мембранаар холбогдсон репликаци-транскрипцийн цогцолбор (RTC) нь 5-?²-терминалын гуравны хоёр болон вирусын бөөмийн үндсэн бүтцийн дэд нэгж, түүнчлэн зарим нэмэлт хэрэгсэлд кодлогдсон байдаг. .Геномын 3??² төгсгөлийн гуравны нэгд кодлогдсон уураг (1).Хавтгай вирүсийн нэг гэр бүлээс (Monoviridae) (8) бусад бүх үүрлэсэн вирусууд RTC дэд хэсгүүдийг хоёр том нээлттэй унших хүрээ (ORF) ORF1a болон ORF1b-д кодлодог бөгөөд эдгээр нь геномын РНХ-ээс орчуулагддаг.ORF1a нь полипротейн (pp) 1a кодчилдог ба ORF1a болон ORF1b нь pp1ab-ийг хамтран кодлодог.ORF1a-аар кодлогдсон үндсэн протеаза (Mpro)-ийн ерөнхий оролцоотойгоор pp1a болон pp1ab хоёулаа протеолитик аргаар боловсруулж, 3CLpro гэгддэг олон төрлийн бүтцийн бус уураг (nsps) болгон хувиргадаг, учир нь энэ нь пикорнавирусын 3Cpro-тэй ижил төстэй байдаг. 9).Эдгээр nsps нь том динамик RTC-д угсарч, геномын РНХ (репликаци) ба дэд геномын РНХ-ийн багц (транскрипц) нийлэгжилтийг хурдасгадаг бөгөөд ORF1b (10? ?12).
Үндсэн RTC нь РНХ-аас хамааралтай РНХ полимераза (RdRp) (13), супер гэр бүлийн 1-геликаза (HEL1) (14, 15) болон хэд хэдэн РНХ боловсруулах ферментүүдийг агуулдаг бөгөөд эдгээр нь ихэвчлэн ORF1b болон коронавирусын гэр бүлд кодлогдсон байдаг. Үүнд nsp12-nsp16 болон Arterioviridae гэр бүлийн nsp9-nsp12 (10ââ 12-ыг үзнэ үү).RdRp ба HEL1 нь шувууны үүрний вирусын хоёр (тавны нэг) хадгалагдсан домайныг төлөөлдөг бөгөөд бусад РНХ вирусуудын дунд ижил төстэй байдаг.Үндсэн репликазыг бусад дэд нэгжүүд, түүний дотор pp1a-ийн карбокси-терминал (С-терминал) бүсээс ялгардаг, Mpro-ийн доод хэсэг (коронавирус nsp5 ба артерийн вирус nsp4 тус тус)-аас ялгардаг хэд хэдэн жижиг nsps тусалдаг гэж үздэг.Тэд хязгаарлагдмал гэр бүлийн хамгаалалт, төрөл бүрийн үйл ажиллагаатай байдаг (10ââ12-р лавлагаа).
Харьцангуй саяхан бүх үүрлэсэн вирусын RdRp-тэй зэргэлдээх амин төгсгөлд (N-төгсгөл) өвөрмөц дарааллын сэдвийн шинж чанартай домэйн олдсон боловч бусад РНХ вирус байхгүй байна (16).Байршил, нуклеотид трансфераза (нуклеозид монофосфат [NMP] трансфераза) үйл ажиллагаанд үндэслэн энэ домайныг NiRAN (Nestvirus RdRp холбоотой нуклеотид трансфераза) гэж нэрлэдэг.NiRAN-RdRp-ийн хос домэйн хослол нь Coronaviridae гэр бүлд nsp12, Arterioviridae гэр бүлд nsp9-ийг бүрдүүлдэг ба бусад нестовиридад NiRAN-RdRp нь вирусын полипротейнээс бие даасан nsp хэлбэрээр ялгарах төлөвтэй байна.Коронавирусын хувьд NiRAN домэйн нь ??1/450 үлдэгдэл агуулсан бөгөөд холбогч бүсээр (16?19) C-терминал RdRp домайнтай холбогддог.Адууны артерит вирус (EAV) (Arteriviridae)-д рекомбинант nsp9 нь Mn2+ ионоос хамааралтай (өөрөө) UMPylation болон GMPylation-ийн үйл ажиллагааг харуулдаг бөгөөд эдгээр нь AN, BN, CN зэрэг нестовирусын хадгалагдсан 3 дарааллын суурь ба дараалал дахь үлдэгдэлээс хамаардаг.Энд N нь NiRAN гэсэн үг) (16).Эдгээр хээний N төгсгөлийн хажуу тал нь бага консерватив preAN мотив юм.Эдгээр үлдэгдлүүдийн зарим нь холын холбоотой уургийн киназад хадгалагддаг бөгөөд тэдгээр нь нуклеозид трифосфат (NTP) холбох болон катализаторын үйл ажиллагаанд оролцдог нь нотлогдсон (20, 21).Энэхүү ажиглалттай нийцүүлэн Pseudomonas syringae-ийн псевдокиназын SelO дахь хэд хэдэн гол идэвхтэй сайтын үлдэгдлийг саяхан хэвлэгдсэн SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 супер цогцолбороор нэгтгэж болно.Хадгалсан Coronavirus NiRAN үлдэгдэл нь электрон бичил бүтцэд давхардсан.Рекомбинант уураг (17).Баримтжуулсан (өөрөө) U/GMPylation нь NMP-ийг (одоогоор тодорхойгүй) субстрат руу шилжүүлэх түр зуурын төлөвийг бий болгоно гэж таамаглаж байна (16), NiRAN болон уураг киназын хоорондох бүтцийн ижил төстэй байдал (17, 19) ) гэсэн таамаглал байна. NiRAN бусад уурагуудыг өөрчилдөг.
Олон шинж чанар, түүний дотор үүрлэсэн вирусуудтай өвөрмөц бөгөөд өвөрмөц системчилсэн холбоо, RdRp-ээс генетикийн тусгаарлалт зэрэг нь NiRAN-ийг үүрлэсэн вирусыг зохицуулах боломжийн гол фермент болгодог бөгөөд энэ нь тэдгээрийн үүсэх, ялгах шинж чанарт чухал ач холбогдолтой юм.Өмнө нь геном/субгеномын орчуулга эсвэл репликац/ транскрипцийг зохицуулах NiRAN-тай холбоотой гурван боломжит функцийг нэрлэсэн.Тухайн үед байгаа хомс, бүрэн бус өгөгдлийг авч үзэхэд функц бүр өөрийн давуу болон сул талуудтай байдаг (16).Энэхүү судалгаанд бид хоёр төрлийн коронавирусын биохимийн болон урвуу генетикийн судалгааг нэгтгэж, энэхүү нууцлаг ертөнцийн талаар ойлголттой болохын тулд олсон үр дүнгээ коронавирусын гэр бүлийн байгалийн мутацийн хувьслын суурь байдалд оруулахыг зорьж байна.Бид RTC дахь байгалийн зорилтуудыг тодорхойлох замаар NiRAN-ийн талаархи ойлголтод томоохон ахиц дэвшил гарсан тухай мэдээлсэн бөгөөд энэ нь (боломжтой гурван таамаглалаас) нь үүрлэсэн вирусын РНХ-ийн нийлэгжилтийг эхлүүлэхэд энэ домэйны үүрэг рольд хувь нэмэр оруулдаг.Энэхүү судалгаа нь вирусын хост интерфейс дээр NiRAN-ийн бусад үүргийг гүйцэтгэх боломжийг нээж өгч байна.
Корона вирусын nsp12-тэй холбоотой NiRAN домэйны ферментийн шинж чанарыг тодорхойлохын тулд бид E. coli-д хүний коронавирус 229E (HCoV-229E) nsp12-ийн рекомбинант хэлбэрийг С төгсгөлд His6 тэмдэглэгээтэй гаргаж, [α32-P ]-тай уураг Материал ба аргад тайлбарласны дагуу MnCl2 байлцуулан NTP-тэй хамт өсгөвөрлөнө.Урвалын бүтээгдэхүүний шинжилгээ нь nsp12 (106 кДа) -тай хамт шилжин суурьшдаг цацраг идэвхт шошготой уураг байгааг харуулсан бөгөөд энэ нь коронавирус nsp12 нь уридин монофосфат (UMP) -тай илүү зохицсон ковалент уураг-NMP нэмэлт бодис үүсэхийг хурдасгадаг болохыг харуулж байна (Зураг 1А) ба B).Тоон шинжилгээ нь бусад нуклеотидуудтай харьцуулахад UMP-ийн нэгдлийн дохионы эрч хүч 2-3 дахин нэмэгдсэн болохыг харуулсан (Зураг 1С).Энэхүү өгөгдөл нь коронавирусын NiRAN домэйны NMP трансферазын урьдчилан таамагласан идэвхжилтэй нийцэж байгаа боловч коронавирусын болон артерийн вирусын NiRAN домэйны нуклеотидын сонголт өөр байгааг харуулж байна.
HCoV-229E nsp12-ийн өөрөө NMPylation үйл ажиллагаа.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 кДа)-г [α-32P] NTP-д 6 мМ MnCl2 байлцуулан 30 минутын турш өсгөвөрлөсөн (дэлгэрэнгүйг Материал ба аргуудаас үзнэ үү).Урвалын бүтээгдэхүүнийг SDS-PAGE-ээр ялгаж, Coomassie гялалзсан хөх өнгөөр будсан.(B) Радио шошготой уургийг фосфорын дүрслэлээр дүрсэлдэг.Nsp12-His6 болон уургийн молекулын массын маркеруудын байрлалыг (килодалтоноор) A ба B хэсэгт үзүүлэв. (C) Цацраг идэвхт дохионы эрчмийг (дундаж ± SEM) бие даасан гурван туршилтаар тодорхойлсон.*P≤0.05.Дохионы хүч (хувь) нь UTP-тэй холбоотой.
Хэдийгээр NiRAN-тай холбоотой ферментийн үйл ажиллагаа нь эсийн өсгөвөрт EAV болон SARS-CoV-ийг хуулбарлахад чухал ач холбогдолтой болох нь нотлогдсон ч (16) NiRAN-ийн тусгай функц болон боломжит зорилтуудыг хараахан тогтоогоогүй байна.Саяхан мэдээлэгдсэн NiRAN болон уургийн киназтай төстэй атираа бүхий уургийн гэр бүлийн бүтцийн ижил төстэй байдал (17, 22) биднийг NiRAN нь бусад уургийн NMPylation-ийг хурдасгадаг гэсэн таамаглалыг шалгахад түлхэц болсон.Бид HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10)-аар кодлогдсон бүтцийн бус уургууд, тус бүр нь C-терминал His6 шошго (SI хавсралт, Хүснэгт S1) агуулсан олон төрлийн гомолог зорилтуудыг үүсгэсэн. эдгээр уурагуудыг nsp12 байгаа эсвэл байхгүй үед [α32-P] уридин трифосфатаар ([α32-P]UTP) өсгөвөрлөнө.Үхрийн сийвэнгийн альбумин болон E. coli-д үүссэн MBP-LacZα хайлуулах уураг нь хяналтын үүрэг гүйцэтгэсэн (Зураг 2А, 1-7 эгнээ).Цацраг шошготой уурагт натрийн додецил сульфат-полиакриламидын гель электрофорез (SDS-PAGE) болон авторадиографийн шинжилгээгээр nsp12, nsp9 агуулсан урвалд хүчтэй цацраг идэвхт дохио байгааг тогтоосон.Дохионы байрлал нь nsp9-ийн молекулын масстай тохирч байгаа нь nsp9-ийн nsp12-зуучлагдсан UMPylation-ийг харуулж байна (Зураг 2B, зам 7).Бусад туршилтын уураг нь UMPylated байгааг илрүүлээгүй нь nsp9 нь nsp12-ийн өвөрмөц субстрат гэсэн дүгнэлтэд хүргэсэн.Зураг 1-д үзүүлсэн өөрөө NMPylation өгөгдлийн дагуу nsp12 нь UMP> аденозин монофосфат (AMP)> гуанозин монофосфат (GMP)> цитидин монофосфат (CMP) гэх мэт үр ашиг нь өөр боловч nsp12 нь бүх дөрвөн NMP-ийг nsp9 руу шилжүүлэх боломжтой. Зураг).3 А ба В).Энэхүү шинжилгээнд ашигласан нөхцөлд (урвал болон өртөх хугацааг богиносгож, nsp12-ийн концентрацийг бууруулах; материал ба арга) nsp12-ийн өөрөө NMPylation-ийг илрүүлэх боломжгүй (Зураг 2B, 7-р эгнээ, Зураг 1В-ийг харьцуулна уу). UMP нь nsp12-оос nsp9 руу шилжсэн үр дүнтэй (мөн олон тойрог) болохыг баталсан.UMP трансферазын идэвхжилд Mn2+ ионууд байх шаардлагатай бөгөөд үүнийг Зураг 3С-д үзүүлсэн шиг, харин Mg2+ байгаа үед UMP трансферазын үйл ажиллагаа хамгийн бага ажиглагдсан ба бусад хоёр валент катионы дэргэд идэвхжил ажиглагдаагүй.Цитидин трифосфат (CTP), гуанозин трифосфат (GTP), аденозин трифосфат (ATP) агуулсан NMPylation шинжилгээнд ижил төстэй өгөгдлийг олж авсан (SI хавсралт, Зураг S1).
HCoV-229E nsp9-ийн nsp12-зуучлалын UMPylation.HCoV-229E nsp12-His6⁺-зуучлагдсан UMPylation идэвхийг үнэлэхийн тулд хэд хэдэн уургийн субстратуудыг (үхрийн ийлдэс альбумин, MBP-lacZα болон ORF1a-аар кодлогдсон C-терминал His6-аар тэмдэглэсэн HCoV-229E nsps цуврал) ашигласан. уураг.Материал, аргад тайлбарласны дагуу nsp12 байхгүй (A) эсвэл (B) байхгүй үед уурагыг [α-32P] UTP-ээр 10 минутын турш өсгөвөрлөнө.А ба В-ийн дээд хэсэгт Coomassie Brilliant Blue-ээр будсан SDS-полиакриламидын гель, А ба В-ийн доод талд харгалзах авторадиограммуудыг харуулав.Уургийн молекулын массын маркерын байрлалыг (килодалтоноор) зүүн талд өгөв.nsp12-His6-ийн байрлал (B, дээд) болон nsp12-His6-г nsp9-His6-тай (B, 7-р эгнээ) инкубацийн үед ажиглагдсан цацраг идэвхт дохиог мөн зааж өгсөн бөгөөд энэ нь [α-32P]UMP-ээс nsp9-His6 хүртэл байгааг харуулж байна. (12.9 кДа) нь туршилтанд хамрагдсан бусад уургийн хувьд ажиглагдаагүй.
HCoV-229E NiRAN-аар үүсгэгдсэн nsp9 NMPylation-ийн биохимийн болон вирус судлалын шинж чанар.(А ба В) Урвалд ашигласан нуклеотидын хамтарсан субстратын үүрэг.NMP12-His6 ба nsp9-His6-г хольж, стандарт NMPylation шинжилгээнд өөр өөр [α-32P] NTP-ийн дэргэд өсгөвөрлөнө.(A, дээд) SDS-PAGE-ээр тусгаарлагдсан Coomassie будсан nsp9-His6.(A, доод) Гельний ижил хэсгийн авторадиограф.(B) Зориулалтын нуклеотидын кофакторын дэргэд харьцангуй идэвхжил (дундаж ± SEM) нь бие даасан гурван туршилтаар тодорхойлогддог.*P≤0.05.(C) Металлын ионуудын үүрэг.[α-32P] UTP ба өөр өөр металлын ионууд, тус бүр нь 1 мМ концентрацитай байгаа стандарт NMPylation тестийг үзүүлэв.С-д дээд талд Coomassie будсан nsp9-His6-г, харин C-д доод талд харгалзах авторентгенографийг үзүүлэв.Шошгологдсон уургийн хэмжээг (килодалтоноор) A ба C-ийн зүүн талд харуулав. (D) Заасан амин хүчлийг орлуулах HCoV-229E nsp12-His6-ийн мутант хэлбэр нь тайлбарласны дагуу [α-32P]UTP-д байна. Материал ба аргад.NMPylation урвалд үүссэн цацрагийн шошготой nsp9-His6 нь фосфоржилтын дүрслэлээр илэрдэг (D, дээд).Зэрлэг төрлийн (wt) уурагтай харьцуулахад харьцангуй идэвхжилийг D-д харуулсан ба доод хэсгийг бие даасан гурван туршилтаас дундаж (±SEM) болгон авсан.Од тэмдэг нь хадгалагдаагүй үлдэгдлийг орлуулахыг заана.(E) Халдвар авснаас хойш 24 цагийн дараа олж авсан p1 эсийн өсгөвөрийн супернатантын вирусын титрийг товрууны шинжилгээгээр тодорхойлсон.Инженерчлэгдсэн HCoV-229E мутантын NiRAN домайн дахь кодон орлуулалтыг зааж өгсөн болно (үлдэгдэл дугаарлалт нь pp1ab дахь байрлал дээр үндэслэсэн).Хуулбарлах дутагдалтай RdRp идэвхтэй сайтын мутант nsp12_DD4823/4AA-г хяналт болгон ашигласан.
NiRAN-ийн идэвхтэй хэсгийн талаар илүү гүнзгий ойлголттой болох, nsp9-өвөрмөц NMP трансферазын үйл ажиллагаатай холбоотой үлдэгдлийг тодорхойлохын тулд бид мутацийн шинжилгээ хийсэн бөгөөд үүнд бид NiRAN AN, BN, CN сэдвүүд дэх консерватив үлдэгдлийг орлуулсан. 16) Энэ бол Ала (SI хавсралт, Зураг S2).Нэмж дурдахад консерватив Arg-to-Lys эсвэл Lys-to-Arg орлуулалтын нөлөөг хоёр тохиолдолд үнэлэв.(Сөрөг) хяналтын хувьд коронавирус болон бусад үүрлэсэн вирусын NiRAN домэйнд хадгалагдаагүй үлдэгдлийг Алагаар солино. K4116A (preAN мотивээр), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (сэдгийг) орлуулна. BN) ба D4280A (CN) нь nsp12-ээр дамжуулан nsp9 NMPylation-ийг эрс багасгаж, бүр устгадаг бол консерватив орлуулалттай (R4178K), K4116R) уургууд нь үйл ажиллагааныхаа 60, 80% -ийг хадгалдаг нь тус тусын хязгаарлалтыг сулруулж байгааг харуулж байна. гинж нь физик-химийн хувьд мэдрэмтгий байдаг (Зураг 3D).Бусад хэд хэдэн хадгалагдсан үлдэгдэл E4145A, D4273A, F4281A болон D4283A-г солих нь хор хөнөөл багатай бөгөөд nsp9 UMPylation нь зөвхөн дунд зэрэг буурдаг.Бусад NTP-үүдийг оролцуулсан nsp9 NMPylation урвалуудад ижил төстэй үр дүнг олж авсан (Зураг 3D ба SI хавсралт, Зураг S3) нь тодорхой амин хүчлийг орлуулахад ажиглагдсан нөлөө нь ашигласан нуклеотидын хамтарсан субстратын төрлөөс хамааралгүй болохыг баталж байна.Дараа нь бид эдгээр nsp12 орлуулалт нь эсийн өсгөвөрт коронавирусын хуулбарлахад үзүүлэх нөлөөллийг туршиж үзсэн.Үүний тулд бид 5-7 эсийг хуулбарлахын тулд рекомбинант вакцины вирүс (23, 24)-д хуваасан генийн инженерчлэгдсэн нэмэлт ДНХ (cDNA) загваруудыг ашигласан.Эдгээр эсүүдэд үүсгэгдсэн халдварт вирусын үр хөврөлийн титр нь HCoV-229E NiRAN мутантуудын ихэнх нь боломжгүй болохыг харуулсан (Зураг 3E).Амьдрах чадваргүй вирусын мутантуудын бүлэгт NMP трансферазын идэвхийг in vitro устгадаг эсвэл мэдэгдэхүйц бууруулдаг хувилбарууд (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), гэхдээ өөр хоёр хувилбар (K4116R, E4105A) байдаг. % нөөцөлсөн үү?Тэдний in vitro NMPylation үйл ажиллагаа нь нэмэлт хязгаарлалттай холбоотой болохыг харуулж байна.Үүний нэгэн адил, NiRAN-ийн in vitro NMPylation идэвхийг дунд зэрэг бууруулсан өөр хоёр мутаци (R4178K, F4281A) нь амьд вирусыг үүсгэсэн боловч эдгээр вирусууд хуулбарлах замаар титрүүдийг мэдэгдэхүйц бууруулсан.Зураг 3D-д үзүүлсэн in vitro үйл ажиллагааны өгөгдөлтэй нийцэж, коронавирус болон/эсвэл бусад үүрлэсэн вирус (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16)-д хадгалагдаагүй өөр дөрвөн үлдэгдлийг орлуулж (8, 16) үр удамд амьдрах чадвартай вирус үүсгэсэн. зэрлэг төрлийн вирустэй харьцуулахад титр бага зэрэг буурсан (Зураг 3E).
NiRAN-зуучлагдсан NMP трансферазын идэвхжил нь идэвхтэй RdRp домэйноос хамаарах эсэхийг судлахын тулд RdRp мотив С дахь хоёр валент металлын ионуудын (11) зохицуулалтад оролцдог хоёр хадгалагдсан Asp үлдэгдлийг Алагаар сольсон. Үр дүнд нь nsp12_DD4823/4AA уураг хадгалагдана. түүний nsp9 NMPylation идэвхжил нь nsp12-ийн зуучлалын in vitro nsp9 NMPylation үйл ажиллагаа нь полимеразын идэвхжил шаарддаггүйг харуулж байна (SI Хавсралт, Зураг S4).
nsp12-д nsp9-ийн өвөрмөц NMP трансфераза идэвхжилийг тогтоосны дараа бид NMP-nsp9 нэмэлтийг масс спектрометрээр (MS) тодорхойлохыг оролдсон.Рекомбинант HCoV-229E nsp9-ийн бүрэн уургийн массын спектр нь 12,045 Да-д оргил цэгийг харуулсан (Зураг 4А).Nsp12-г нэмснээр nsp9-ийн чанар өөрчлөгдөөгүй бөгөөд энэ нь nsp12 болон nsp9 нь ашигласан нөхцөлд (денатураци) тогтвортой цогцолбор үүсгэхгүйг харуулж байна (Зураг 4А).UTP болон GTP байгаа үед nsp9 ба nsp12 агуулсан урвалын массын хэмжилтээр UTP-ийн уургийн масс 306 Да, GTP-ийн уургийн масс 345 Да хөдөлсөн нь nsp9 молекул бүр UMP эсвэл GMP-ийг холбодог болохыг харуулж байна. (Зураг 4) C ба D).NiRAN-аар дамждаг nsp9 NMPylation-д шаардагдах энерги нь NTP гидролиз ба пирофосфатын ялгаралтаас гардаг гэж таамаглаж байна.Хэдийгээр энэ урвалд nsp12 (фермент) -ээс 10 дахин их молийн nsp9 (зорилтот) ашигласан боловч nsp9-ийн бараг бүрэн NMPylation ажиглагдсан нь nsp12 болон nsp9 хоорондын харилцан үйлчлэл нь богино хугацаатай бөгөөд nsp12 нь илүү их nsp9-ийг NMPжуулж чаддаг болохыг харуулж байна. in vitro молекул.
nsp12 болон UTP эсвэл GTP-ийн дэргэд nsp9-ийн нэг NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI хавсралт, Хүснэгт S1) (AD)-ийн задарсан бүрэн уургийн массын спектрийг үзүүлэв.(A) nsp9 дангаараа, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP байгаа үед, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP байгаа үед.
NSP9-ийн үлдэгдлийг тодорхойлохын тулд nsp12-ээр баяжуулсан nsp9-UMP-ийг трипсинээр таслав.Үүссэн пептидүүдийг нано өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографи (HPLC) аргаар салгаж, онлайнаар тандем масс спектрометрээр (MS/MS) шинжилгээ хийсэн.Byonic програм хангамжийн багц (Уургийн хэмжүүр) ашиглан өгөгдлийн шинжилгээ нь N-терминал амин хүчлийн UMPylation-ийг харуулсан.Үүнийг гараар баталгаажуулдаг.Урьдчилсан пептидийн [UMP]NNEIMPGK (SI хавсралт, Зураг S5A)-ийн тандем масс спектр нь 421 м/z хурдтай фрагментийг илрүүлсэн нь UMP нь nsp9-ийн 1-р үлдэгдэлтэй холбогддог болохыг харуулж байна.
Nsp9-ийн N төгсгөлд Asn нь Orthocoronavirinae-ийн гишүүдийн дунд хадгалагддаг (SI хавсралт, Зураг S6).Хэдийгээр бид N-терминалын анхдагч амин азотыг UMP-ийн хамгийн их хүлээн авагч гэж үзэж байгаа ч бид N-терминал дээр NMP-ийг холбосон нэмэлт нотолгоог олж авахаар шийдсэн.Энэ шалтгааны улмаас HPLC-ээр цэвэршүүлсэн NMPyted ба NMPylated N-терминал пептид nsp9-ийг ацетон болон натрийн цианоборогидридын дэргэд гаргаж авсан.Эдгээр нөхцөлд зөвхөн чөлөөт анхдагч аминуудыг пропил (25) -аар өөрчилж болно.NNEIMPGK дараалалтай N-терминал nsp9-аас гаралтай пептид нь хоёр үндсэн аминыг агуулдаг бөгөөд нэг нь Asn-ийн N-төгсгөлд, нөгөө нь C-төгсгөлд Lys-ийн хажуугийн гинжин хэлхээнд байдаг.Тиймээс пропилийн бүлгийг хоёр төгсгөлд нэвтрүүлж болно.NMPylated биш пептидүүдийн гаргаж авсан ионы хроматограммыг SI хавсралт, Зураг S5B-д үзүүлэв.Хүлээгдэж буйгаар N-терминал ба С-терминал (моно)пропилат (SI хавсралт, Зураг S5B, дээд эгнээ) болон дипропилжүүлсэн пептидүүд (SI хавсралт, Зураг S5B, доод эгнээ) тодорхойлж болно.Энэ загвар нь nsp9-ийн NMPylated N-терминал пептидийг ашигласнаар өөрчлөгддөг.Энэ тохиолдолд зөвхөн C-терминал пропилжүүлсэн пептидүүдийг тодорхойлох боломжтой боловч N-терминал пропиляцилагдсан пептидүүд болон дипропилжүүлсэн пептидүүд тодорхойлогдоогүй (SI Хавсралт, Зураг S5C) нь UMP нь N-терминалын анхдагч аминд шилжсэнийг харуулж байна. Үүнээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд бүлэг өөрчлөлт хийх.
Дараа нь бид зорилтот тусгай хязгаарлалтыг тодорхойлохын тулд nsp9-ийн N-төгсгөлд хадгалагдсан үлдэгдлийг (Ala эсвэл Ser-ээр) сольж эсвэл устгадаг.NiRAN нь nsp9-ийн N-терминалын үлдэгдлийн үндсэн аминтай хамт nsp9-NMP нэмэлтийг үүсгэдэг болохыг харуулсан манай MS-ийн өгөгдөл дээр үндэслэн бид nsp9 NMPylation нь nsp9 N-терминалыг ялгаруулахын тулд вирусын мастер протеазыг (Mpro, nsp5) шаарддаг гэсэн таамаглал дэвшүүлсэн. түүний полипротеины урьдал бодис.Энэ таамаглалыг шалгахын тулд бид E. coli-д nsp9 агуулсан nsp7-11 прекурсор уураг гаргаж, [α-32P] UTP (материал ба арга) -ын дэргэд стандарт NMPylation тест хийсэн.Зураг 5А-д (3-р эгнээ) үзүүлснээр огтлоогүй nsp7-11 прекурсорыг nsp12-ээр цацрагаар тэмдэглээгүй.Үүний эсрэгээр, хэрэв nsp7-11 нь рекомбинант nsp5-ээр задарч, урьдал бодисоос nsp9 (болон бусад nsps) ялгардаг бол nsp9-тэй хамт шилжин суурьшдаг цацрагийн шошготой уураг илэрсэн нь NiRAN ба N- ковалент nsp9-NMP нэмэлтүүдийн сонгомол үүсэх гэсэн бидний дүгнэлтийг баталж байна. .N-терминал Asn-ийн терминалын анхдагч амин (pp1a/pp1ab дахь байрлал 3825).Энэхүү дүгнэлтийг N-төгсгөлд нэг эсвэл хоёр нэмэлт үлдэгдэл агуулсан nsp9 бүтцийг ашиглан хийсэн туршилтууд мөн баталж байна.Аль ч тохиолдолд nsp9-ийн NiRAN-зуучлалын UMPylation хүчингүй болсон (SI Хавсралт, Зураг S7).Дараа нь бид nsp9-ийн N-терминал дахь 3825-NNEIMPK-3832 пептидийн дарааллаас устгагдсан нэг эсвэл хоёр Asn үлдэгдэл бүхий уураг гаргаж авсан.Аль ч тохиолдолд nsp9 UMPylation нь бүрэн хаагдсан (Зураг 5B) нь жинхэнэ nsp9 N-терминус нь NMP рецепторын үүрэг гүйцэтгэдэг гэсэн нэмэлт нотолгоо юм.
Nsp9-ийн протеолитик боловсруулалт ба nsp12-зуучлалын UMPylation дахь N-терминал үлдэгдэлийн үүрэг.(A) nsp9 UMPylation нь үнэгүй nsp9 N-терминал шаарддаг.Nsp7-11-His6 нь рекомбинант Mpro (nsp5-His6) байгаа эсвэл байхгүй үед UTP агуулсан NMPylation илрүүлэх буферт 30 ° C-т урьдчилан өсгөвөрлөнө.3 цагийн дараа Материал ба арга хэсэгт тайлбарласны дагуу nsp12-His6 нэмж NMPylation шинжилгээг эхлүүлнэ.nsp5-His6 (1-р эгнээ) ба nsp9-His6 (2-р эгнээ) агуулсан урвалыг хяналт болгон ашигласан.10 минутын дараа урвалыг зогсоож, урвалын хольцыг SDS-PAGE-ээр тусгаарлав.Уургийг Coomassie Brilliant Blue (A, дээд) өнгөөр будсан.Баруун талд Nsp7-11-His6-ийн прекурсор ба nsp5-His6-ийн зуучлалын үр дүнд үүссэн боловсруулсан бүтээгдэхүүнийг харуулав.nsp7 ба nsp11-His6 нь энэ гель дотор илрэхгүй, урвалыг nsp5-His6 (1 ба 4-р эгнээ; nsp5-His6-ийн байрлалыг цул дугуйгаар тэмдэглэсэн) нэмсэн болохыг (жижиг хэмжээтэй учраас) анхаарна уу. эсвэл nsp9-His6 (2-р эгнээ) нь MBP хайлуулах уураг хэлбэрээр илэрхийлэгддэг тул үлдэгдэл хольц хэлбэрээр бага хэмжээний MBP (нээлттэй дугуйгаар тэмдэглэсэн) агуулдаг (SI хавсралт, Хүснэгт S1).(B) Nsp9-His6 хувилбарт нэг эсвэл хоёр N-терминал Asn үлдэгдэл байхгүй (pp1a/pp1ab дахь байрлалын дагуу үлдэгдлийг дугаарлах) ба nsp12-His6 болон [α-32P] UTP-ээр цэвэршүүлэн өсгөвөрлөнө.B, Coomassie-ээр будсан SDS-PAGE-г дээд талд, B-д харгалзах авторадиографыг доод талд харуулав.Молекулын жингийн маркерын байрлалыг (килодалтоноор) зүүн талд харуулав.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-терминал хадгалагдсан үлдэгдлийг Ала эсвэл Ser-ээр сольж, nsp12-His6 зуучлалын UMPylation урвалд ижил хэмжээний уураг ашигласан.Урвалын бүтээгдэхүүнийг SDS-PAGE-ээр ялгаж, Coomassie Brilliant Blue (C, дээд) өнгөөр будаж, цацраг идэвхт шошготой nsp9-His6 нь фосфоресценцийн дүрслэлээр (C, дунд) илэрсэн.Зэрлэг төрлийн (wt) уургийг жишиг болгон (100% гэж тохируулсан) ашиглан харьцангуй NMPylation идэвхийг (дундаж ± SEM) гурван бие даасан туршилтаар тооцоолсон.(D) HCoV-229E зэрлэг төрлийн Huh-7 эсүүдээр халдварласан Huh-7 эсийн p1 эсийн өсгөвөрийн супернатант дахь вирусын титр, nsp9-д амин хүчлийн зориулалтын орлуулалт агуулсан мутантуудыг товрууны шинжилгээгээр тодорхойлсон.Хуулбарлах дутагдалтай RdRp мотив C давхар мутант DD4823/4AA-г сөрөг хяналт болгон ашигласан.
Nsp9-ийн N-төгсгөл (ялангуяа 1, 2, 3, 6-р байрлалууд) нь Orthocoronavirinae дэд бүлгийн гишүүдийн дунд маш их хадгалагддаг (SI хавсралт, Зураг S6).Эдгээр үлдэгдлүүдийн nsp12-зуучилсан nsp9 NMPylation-д гүйцэтгэх үүргийг судлахын тулд nsp9-ийн N-төгсгөл дээрх хоёр дараалсан Asn үлдэгдлийг Ала эсвэл Ser (дангаараа эсвэл хослуулан) сольсон.Зэрлэг төрлийн nsp9-тэй харьцуулахад N3825-ийг Ala эсвэл Ser-ээр солих нь nsp12-ээр дамждаг UMPylation-ийг хоёр дахин бууруулсан (Зураг 5C).N-терминалын үлдэгдлийн хажуугийн гинжин хэлхээний оронд N-терминал анхдагч аминд NMPylation явагддаг гэсэн бидний дүгнэлттэй нийцэж, N3825A ба N3825S-ийг сольсноор мэдэгдэхүйц үлдэгдэл NMPylation ажиглагдсан.Сонирхолтой нь, хэрэв хоёр дахь Asn-ийг Ала эсвэл Сэрээр сольсон бол nsp9 UMPylation илүү хүчтэй буурдаг (10-аас дээш удаа), харин 3, 4, 6-р байрлалд Ала-г солих нь nsp9 UMPylation дээр зөвхөн дунд зэргийн нөлөө үзүүлдэг (Зураг 2) ).5C).Үүнтэй төстэй үр дүнг ATP, CTP эсвэл GTP ашиглан олж авсан (SI хавсралт, Зураг S8).Эдгээр өгөгдөл нь nsp9 NMPylation дахь N2826 (nsp9-ийн 2-р байр) гол үүргийг харуулж байна.
Nsp9 ба NMPylation-ийн N-төгсгөлийн хоорондох функциональ хамаарлын нэмэлт нотолгоог олж авахын тулд бид Коронавирусын гэр бүлийн nsp9 дарааллын (104-113 үлдэгдэл хооронд хэлбэлздэг) олон дарааллын тохируулга (MSA) хийсэн (SI Хавсралт, Зураг). S6).Янз бүрийн хөхтөн амьтан, шувууд, мөлхөгч амьтдад халдварладаг Orthocoronavirinae дэд овгийн 47 (мэдэгдэж байгаа болон таамагласан) зүйлд зөвхөн 8 үлдэгдэл өөрчлөгддөггүй байна.Устгах, оруулах зэрэг хамгийн өргөн хүрээтэй өөрчлөлтүүд нь өмнөх бүтцийн судалгаагаар тогтоогдсон nsp9-ийн хоёрдогч бүтцийн элементүүдийн хоорондох мөчлөгт ажиглагдсан (26 ??28).nsp9-ийн С төгсгөлийн хэсгийн β хэлхээ болон α спиральд 5 өөрчлөгдөөгүй үлдэгдэл илэрсэн.Гурван инвариант үлдэгдэл нь nsp9-ийн N төгсгөлийн NNE мотивийг бүрдүүлдэг.Энэ сэдвийн хоёр дахь Asn нь алс холын хамаарал бүхий мэлхийн коронавирусын таамагласан nsp9-д хамаарах цорын ганц хувиршгүй үлдэгдэл бөгөөд Альфалетовирүсийн Letovirinae дэд бүлгийн Microhyla letovirus 1 зүйлийг төлөөлдөг болох нь тогтоогдсон.NSP9-ийн хоёрдогч бүтцийн элементүүд дэх үлдэгдлийг хадгалах нь эвхэгддэг эсвэл мэдэгдэж буй РНХ-ийн холболтын шинж чанарыг хадгалахын тулд бүтцийн үүднээс оновчтой болгох боломжтой.Гэсэн хэдий ч энэхүү үндэслэл нь NNE-ийн хадгалалтад хамаарахгүй мэт санагдаж байгаа бөгөөд энэхүү судалгаанаас өмнө трипептидийн дарааллын өөрчлөлтийг хязгаарладаг хязгаарлалтын мөн чанарыг бүрэн бүрхсэн байсан.
Коронавирусын репликаци дахь nsp9-NMPylation болон NNE хадгалалтын ач холбогдлыг тодорхойлохын тулд бид nsp9 N-терминалын үлдэгдлийг дан эсвэл давхар орлуулах HCoV-229E мутантуудыг үйлдвэрлэсэн нь nsp9 NMPylation нь in vitro хор хөнөөлтэй болохыг харуулж байна.Эхлэхээсээ өмнө бид эдгээр орлуулалтууд (nsp8|9-ийн задралын талбайн ойролцоо) C-терминал pp1a бүсийн протеолитик боловсруулалтад нөлөөлж байна уу гэсэн асуултанд хариулахыг хичээнэ.Nsp9-ийн N-төгсгөлд харгалзах орлуулалтыг агуулсан nsp7-11 полипротейн бүтцийн багцыг E. coli-д гаргаж, рекомбинант Mpro-ээр таслав.Эдгээр уургуудын Mpro-зуучлагдсан nsp8|9 задралд саад учруулдаг бүтцийн өөрчлөлтийг эс тооцвол (SI хавсралт, Зураг S9) дөрвөн хэсгийн уураг задлах задралд (nsp9-ийн хажуугийн хэсгийг оруулаад) ямар нэгэн орлуулалт төдийлөн нөлөөлдөггүй. вэб сайт.
Huh-7 эсүүд нь геномын урттай HCoV-229E РНХ-ээр дамжин nsp9 N төгсгөлд хадгалагдсан NNE трипептид (N3825, N3826, E3827) дахь Ала эсвэл Ser орлуулалтыг кодлосон нь ихэнх мутаци нь үхэлд хүргэдэг болохыг харуулж байна.Бид N-терминал Asn (N2835A эсвэл N2835S)-ийн Ser эсвэл Ala-г орлуулж вирусыг аварч чадсан боловч NNE дарааллын нэг болон давхар мутаци (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Зураг 5D).
Эдгээр үр дүн нь эдийн өсгөвөрт коронавирусын хуулбарлах нь хязгаарлагдмал (ижил эсвэл ижил төстэй), бие дэх nsp9 NMPylation сайтуудын байгалийн мутацийг хязгаарлаж, коронавирусын амьдралын мөчлөгт энэхүү хариу урвалын гол үүргийг дэмжиж байгааг харуулж байна.
Сүүлчийн багц туршилтаар бид SARS-CoV-2 nsp12 ба nsp9 гэсэн шошготой C-терминал His6 болон E. coli-д nsp12-ийн мутант хоёр хэлбэрийг үйлдвэрлэсэн.NiRAN болон RdRp домэйн дэх идэвхтэй сайтын үлдэгдэл нь оронд нь Ala-г ашигла (Зураг 6А ба SI хавсралт, Хүснэгт S2).SARS-CoV-2 nsp12 дахь K4465 нь HCoV-229E-ийн K4135-тай тохирч байна (SI Хавсралт, Зураг S2) нь NiRAN идэвхжил болон HCoV-229E-ийн хуулбарлахад шаардлагатай болох нь батлагдсан (Зураг 3D ба E).Энэ үлдэгдэл нь мөн артерийн вирусын EAV nsp9 K94 үлдэгдэлтэй тохирч байгаа бөгөөд энэ нь өмнө нь NiRAN-ийн өөрөө UMPylation/self-GMPylation (16) шаардлагатай гэдгийг харуулсан.Зураг 6В-д үзүүлснээр SARS-CoV-2 nsp12 нь nsp9-ийг субстрат болгон ашигладаг UMP трансфераза идэвхжилтэй байхад nsp12_K4465A идэвхтэй сайтын мутант идэвхгүй байна.RdRp motif C-ийн SDD шинж чанарын дараалал дахь давхар орлуулалт нь UMP трансферазын идэвхжилд нөлөөлөхгүй (Зураг 6B) нь RdRp идэвхжил нь nsp9 UMPylation-д шууд нөлөө үзүүлэхгүйг харуулж байна.Үүнтэй төстэй өгөгдлийг CTP, GTP болон ATP ашиглан олж авсан (SI хавсралт, Зураг S10).Дүгнэж хэлэхэд эдгээр өгөгдлүүд нь NiRAN-аар дамждаг nsp9 NMPylation нь ортокоронавирусын дэд бүлгийн өөр өөр генийг төлөөлдөг коронавирусуудад консерватив идэвхжилтэй болохыг харуулж байна.
SARS-CoV-2 nsp12-зуучлан nsp9-ийн NMPylation.(A) NMPylation тестэд ашигласан рекомбинант уургийг харуулсан Coomassie будсан SDS-полиакриламид гель.Хяналтын хувьд SARS-CoV-2 nsp12-ийн NiRAN домэйн (K4465A) ба RdRp домэйн (DD5152/3AA) дахь идэвхтэй орлуулалт бүхий мутант уураг ашигласан.Үлдэгдэл дугаарлалт нь pp1ab дахь байрлал дээр суурилдаг.(B) nsp9-His6 ба [α-32P]UTP-ийг nsp12-His6 (зэрлэг төрөл [wt] ба мутант)-ийн субстрат болгон ашиглан UMPylation илрүүлэх авторадиограф.Зүүн талд шошготой уургийн молекулын массыг (килодалтоноор) харуулав.
NiRAN домэйнууд ерөнхийдөө Нидовиралес (16)-д хадгалагддаг бөгөөд энэ нь Нидовирүсийн репликаци хийхэд шаардлагатай ферментийн урвалыг катализ болгодог болохыг харуулж байна.Энэхүү судалгаагаар бид коронавирусын NiRAN домэйн нь NMP-ийг (NTP-ээс үүсгэгдсэн) вирусын хуулбарлахад оролцдог нууцлаг РНХ холбогч уураг болох nsp9 руу (26 ?? 29) шилжүүлж, түүнийг байгалийн зорилтот ба мөн болохыг нотолж чадсан. коронавирусын RTC-ийн түнш.
NiRAN домэйн нь гурван дарааллын мотивийг (AN, BN, CN) хуваалцдаг бөгөөд тэдгээр нь маш цөөн тооны үлдэгдэл агуулдаг бөгөөд тэдгээр нь монофилтик боловч маш их ялгаатай Нидовиралес дарааллаар хадгалагддаг (8, 16).Сүүлийн үеийн судалгаагаар тэдгээр нь үндсэндээ SelO-ийн гэр бүл гэж нэрлэгддэг уургийн киназ төст уургийн үндсэндээ тодорхойгүй гэр бүлтэй бүтцийн хувьд холбоотой болохыг харуулсан (17, 19, 22, 30, 31).SelO-тэй холбоотой уургууд нь киназын атираатай боловч сонгодог киназад хэд хэдэн хадгалагдсан идэвхтэй талбайн үлдэгдэл байдаггүй (22, 32).Идэвхтэй газартай холбогдож, тодорхой харилцан үйлчлэлээр тогтворжсон ATP молекулуудын урвуу чиг баримжаа дээр үндэслэн SelO нь AMP (фосфатын оронд) уургийн субстрат руу (22) шилждэг болох нь батлагдсан бол өөр нэг бактерийн SelO төст уураг YdiU байна. Уургийн өөр өөр субстратуудын Тир ба Түүний үлдэгдэлд UMP-ийн ковалент холболтыг хурдасгадаг нь саяхан батлагдсан (33).
Коронавирусын NiRAN домэйны идэвхтэй талбайн үлдэгдлийн таамаглалыг баталгаажуулах, өргөжүүлэхийн тулд бид nsp12 коронавирусын мутацийн шинжилгээ хийхэд биохимийн болон урвуу генетикийн аргуудыг ашигласан (Зураг 3D ба E ба SI хавсралт, Зураг S3 ба хүснэгт) S1â S4).Өгөгдөл нь HCoV-229E K4135, R4178, D4280-ийг Алагаар солих нь in vitro NMP трансферазын идэвхжил, эсийн өсгөвөрт вирусын репликацийг арилгадаг (Зураг 3D ба E ба SI хавсралтууд, Зураг S3), NTP γ-фосфат дахь тэдгээрийн оршихуйг дэмждэг. ( K4135, R4178) ба идэвхтэй талбайн металл ионуудын зохицуулалт (D4280).K4135 (17) байрлалыг тогтворжуулна гэж таамаглаж буй шувууны үүрний вирусын хүрээнд E4145A хадгалагдсан Цавууг орлуулах нь вирусын репликацийг устгадаг болохыг харуулсан боловч гайхалтай нь in vitro NMPylation шинжилгээнд идэвхжил хадгалагдан үлджээ (Зураг 3D ба E ба). SI хавсралт, Зураг S3 ба хүснэгт S1–S4).Salmonella typhimurium (E130A) (33)-ийн YdiU гомологт тохирох орлуулалтыг нэвтрүүлэх үед ижил төстэй ажиглалт хийсэн.Эдгээр өгөгдөл нь катализаторын функцээс илүүтэйгээр хадгалагдсан үлдэгдлийг зохицуулах функцийг дэмждэг.
HCoV-229E NiRAN домэйн (8) дахь нестовирусын хүрээнд хадгалагдсан Phe үлдэгдлийг (F4281A) сольсноор in vitro NMPylation идэвхжил буурч, эсийн өсгөвөрт вирусын репликац мэдэгдэхүйц буурсан байна (Зураг 3D, E болон SI) хавсралт, Зураг S3).Өгөгдөл нь энэ үлдэгдлийн чухал зохицуулалтын функцтэй нийцэж байна, тухайлбал өмнө нь үзүүлсэн нэгэн төрлийн DFG motif Phe үлдэгдэл.Сонгодог уургийн киназын хувьд энэ нь Mg2+ холбох гогцооны нэг хэсэг бөгөөд нурууг угсарч, зохицуулахад тусалдаг уу???Үр дүнтэй катализаторын үйл ажиллагаанд шаардлагатай (32, 34).K4116 үлдэгдлийг (preAN мотивд) Ала, Арг орлуулах нь вирусын репликацийг устгаж, оруулсан амин хүчлийн хажуугийн гинжин хэлхээнээс хамааран NMP трансферазын идэвхжилд in vitro өөр өөр нөлөө үзүүлсэн (Зураг 3D ба E ба SI хавсралтууд). , Зураг S3).Функциональ өгөгдөл нь бүтцийн мэдээлэлтэй нийцэж байгаа нь энэ үлдэгдэл нь ATP фосфаттай харилцан үйлчлэлцсэнийг харуулж байна (17).Бусад үүрлэсэн вирусын гэр бүлийн NiRAN домэйнд HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116-ийн байрлалыг Lys, Arg эсвэл His (8) эзэлж байгаа нь энэхүү өвөрмөц үлдэгдлийн функциональ хязгаарлалт суларсаныг харуулж байна.D4188A болон D4283A-ийг орлуулах нь ферментийн идэвхийг арилгах эсвэл хүчтэй бууруулж, вирусын хуулбарыг арилгадаг (Зураг 3).Эдгээр хоёр үлдэгдэл нь ихэнх (гэхдээ бүгд биш) үүрлэсэн вирусуудад (8) хадгалагддаг бөгөөд энэ нь гэр бүлд хамаарах чухал боловч каталитик бус функцийг харуулж байна.Coronaviridae болон бусад Nestioviridae гэр бүлд (8) хадгалагдаагүй өөр хэд хэдэн Lys болон Asp үлдэгдэл (K4113A, D4180A, D4197A болон D4273A)-ийн Ала орлуулалтыг хяналт болгон ашигласан.Хүлээгдэж буйгаар эдгээр орлуулалт нь ихэнх тохиолдолд тэсвэрлэх чадвартай бөгөөд зарим тохиолдолд ферментийн идэвхжил бага зэрэг буурч, вирусын репликаци бага зэрэг буурдаг (Зураг 3 ба SI хавсралт, Зураг S3).Ерөнхийдөө коронавирусын мутагенезийн өгөгдөл нь EAV nsp9 (коронавирус nsp12 ortolog) үлдэгдэл K94 (HCoV- 229E K4135) чухал үүрэг гүйцэтгэдэг EAV NiRAN-RdRp (16)-ийн өөрөө GMP болон урвуу генетикийн өгөгдөлтэй маш нийцэж байна. R124 (R4178-д харгалзах), D132 (D4188-д харгалзах), D165 (D4280-д харгалзах), F166 (F4281-д харгалзах).Нэмж дурдахад HCoV-229E мутагенезийн өгөгдөл нь өмнө нь мэдээлэгдсэн SARS-CoV урвуу генетикийн өгөгдөлтэй (16) нийцэж, өргөжсөн бөгөөд энэ нь харгалзах CN мотив Phe-to-Ala мутант SARS-CoV_nsp12-д ажиглагдсантай маш төстэй юм. фенотип -F219A ба HCoV-229E_F4281A (Зураг 3 D ба E ба SI хавсралт, Зураг S3 ба Хүснэгт S1-S4).
UTP ба GTP-ийг илүүд үздэг (өөрөө NMPylation урвалд) EAV orthologs (16)-тай харьцуулахад бидний судалгаагаар коронавирусын NiRAN домэйн (HCoV-229E ба SARS-CoV-2) үр дүнтэй байж болохыг харуулж байна. шилжүүлсэн Бүх дөрвөн NMP, UMP-ийг бага зэрэг илүүд үздэг (Зураг 1 ба 3).NTP-ийн тусгай субстратын харьцангуй бага өвөрмөц чанар нь саяхан мэдээлэгдсэн SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 супер нийлмэл бүтэцтэй нийцэж байгаа бөгөөд ADP-Mg2+ нь NiRAN-ийн идэвхтэй хэсэгт холбогддог боловч аденин хэсэгтэй холбогддоггүй. тодорхой харилцан үйлчлэл үүсэх тухай (17).Бидний судалгаагаар NMPylation урвалд ашигласан нуклеотидын төрөл нь мутант уургийн идэвхжилд ялгавартай нөлөө үзүүлэхгүй (SI Хавсралт, Зураг S3) нь эдгээр үлдэгдлүүдийн аль нь ч тодорхой нуклеобазыг холбохтой нягт холбоогүй болохыг харуулж байна.Коронавирус болон артерийн вирусын NiRAN домэйнд ажиглагдсан NTP-ийн өөр өөр субстратуудын бүтцийн үндэс, боломжит биологийн ач холбогдлыг судлах шаардлагатай хэвээр байна;тэдгээр нь үнэн байж магадгүй эсвэл тус тусын судалгааны хязгаарлалтаас үүдэлтэй байж болно.Одоогийн байдлаар артерийн вирусын NiRAN домэйны NMPylator-ийн боломжит идэвхжил (өмнө нь тодорхойлогдсон өөрөө NMPylation үйл ажиллагаатай харьцуулахад) артерийн болон коронавирусын хоорондох ижил төстэй байдлыг харгалзан өөр өөр ко-субстратын давуу талтай байхыг үгүйсгэх аргагүй юм. NiRAN домэйн хязгаартаа байна.Дараалалд суурилсан харьцуулах (16).Mg2+-ийг кофактор болгон ашигладаг псевдокиназа SelO-тай харьцуулахад коронавирус ба артерийн вирүсийн NiRAN-ийн идэвхжил Mn2+ (16)-аас хамаардаг (Зураг 3C ба SI хавсралт, Зураг S1).Mn2+-ийн хамаарал, UTP-ийг илт илүүд үздэг нь NMPylators уургийн ер бусын шинж чанар бөгөөд саяхан Salmonella typhimurium-ийн YdiU уурагаар батлагдсан бөгөөд энэ нь эсийг стресс үүсэхээс хамгаалахын тулд Mn2+-аас хамааралтай уургийн шапероны UMPylation-ийг хурдасгадаг. 33).
Коронавирусын NiRAN домэйн болон эсийн уураг киназын хооронд саяхан тодорхойлсон бүтцийн ижил төстэй байдал (17, 19) нь бидний энэ судалгаанд мэдээлсэн NMP-ийг бусад уурагтай ковалент байдлаар холбох NiRAN-ийн чадварыг нэмэлт дэмжлэг болгон өгдөг.Бид RTC-ийн ORF1b-кодлогдсон хуулбарыг шууд болон шууд бусаар дэмждэг HCoV-229E ORF1a-аар кодлогдсон уургууд дээр NiRAN-ийн боломжит зорилтуудыг эрэлхийлсэн (12, 35).Бидний туршилтууд нь nsp9-ийн үр дүнтэй, өвөрмөц NMPylation-ийн баттай нотолгоог өгдөг (Зураг 2).Хэрэв зорилтот уураг нь ферментээс (nsp12) 8-10 дахин их молийн илүүдэлтэй байвал nsp9 бүрэн (моно) NMP-тэй болох нь батлагдсан (Зураг 4).Бид nsp12 ба nsp9-ийн харилцан үйлчлэл нь богино хугацаатай бөгөөд nsp9-тэй тогтвортой цогцолбор үүсгэхгүй (RTC бусад дэд нэгж байхгүй тохиолдолд) гэж дүгнэсэн.Энэхүү дүгнэлтийг SARS-CoV протеомын уургийн харилцан үйлчлэлийн судалгаагаар баталж байна (35).MS шинжилгээгээр nsp9-ийн N-терминал үлдэгдлийн анхдагч аминыг NMPylation сайт гэж тодорхойлсон (SI хавсралт, Зураг S5).Фосфорамидын холбоо ба N-терминал амин бүлэг үүсэх нь NiRAN-зуучлалын NMPylation идэвхийг Pseudomonas syringae SelO-зуучлагдсан AMPylation урвалаас ялгадаг бөгөөд энэ нь Ser, Thr, эсвэл Tyr үлдэгдэл пептидийн нэмэлт ( 22), болон S. typhimurium YdiU нь O-холбогдсон (Tyr-тай) ба N-холбогдсон (Түүний) пептид-UMP нэмэлтүүдийг үүсгэдэг.SelO гэр бүлийн уургийн талаарх хязгаарлагдмал мэдээлэл нь энэхүү том уургийн гэр бүлийн гишүүд пептид-NMP нэмэлтүүд үүсэхэд ихээхэн ялгаатай болохыг харуулж байна.Энэ бол цаашид судлах шаардлагатай сонирхолтой ажиглалт юм.
Энэхүү судалгаагаар олж авсан өгөгдөл нь nsp9-ийн NMPylation нь чөлөөт N-төгсгөл шаарддаг гэсэн таамаглалыг бидэнд хүргэсэн.Вирусын репликацийн нөхцөлд үүнийг Mpro болон pp1ab-ийн зуучлагч полипротеины pp1a хуулбар дахь nsp8|nsp9 боловсруулах талбайн протеолитик задралаар хангана.Ихэнх коронавирусуудад энэ өвөрмөц сайт (HCoV-229E-ийн VKLQ|NNEI) болон бусад бүх төрлийн коронавирусын Mpro задрах газруудын хоорондох ялгаа нь Asn (Ала, Сер эсвэл Гли гэх мэт жижиг үлдэгдэл гэхээсээ илүү) P1â-г эзэлдэг үү???Байршил (36).Эрт үеийн судалгаагаар олж авсан пептидийн задралын өгөгдөл нь nsp8|nsp9 сайтын задралын үр ашиг нь бусад сайтуудынхаас доогуур байгааг харуулсан нь 1) энэ тодорхой хэсэг нь C-терминалыг цаг тухайд нь зохицуулахад зохицуулах үүрэгтэй байж болохыг харуулж байна. pp1a бүс, эсвэл 2) a Вирусыг хуулбарлахад тусгай хамгаалагдсан nsp9 N-терминусын үүрэг (37).Бидний өгөгдөл (Зураг 5А) бодит N-терминал дарааллыг агуулсан nsp9-ийн рекомбинант хэлбэрийг nsp12-ээр үр дүнтэй NMP болгосон болохыг харуулсан.N-терминалын хажуугийн дарааллыг Xa хүчин зүйл (nsp9-His6; SI хавсралт, Хүснэгт S1) эсвэл Mpro-зуучлагдсан хуваагдал (nsp7-11-His6; Зураг 5А ба SI хавсралт, Хүснэгт S1) -аар арилгасан.Чухал зүйл бол огтлоогүй nsp9 агуулсан прекурсор nsp7-11-His6 нь nsp12-ийн NMPylation-д тэсвэртэй байсан нь бидний өгөгдөлтэй нийцэж байгаа нь nsp9-NMP нэмэлт нь N-терминал анхдагч аминаар дамжин үүсдэг болохыг харуулж байна (SI хавсралт, Зураг S5) .NiRAN субстратын өвөрмөц байдлын талаар илүү гүнзгий ойлголттой болохын тулд бид nsp9-ийн зэргэлдээх N-терминал үлдэгдэл дээр анхаарлаа төвлөрүүлэв.Бусад уураг байхгүй тохиолдолд тэдгээр нь бүтцийн хувьд уян хатан байдаг тул тэдгээрийг nsp9 (26 28, 38) гэж тэмдэглэгдээгүй хэлбэрээр илрүүлэхээс сэргийлж, тэдгээрийн хязгаарлагдмал байгалийн өөрчлөлтийг харуулж байна. Энэ нь чухал дараалалд хамаарах (хоёрдогч бүтэцтэй холбоогүй) холбоотой юм. nsp9 N-терминал фрагментийн функц.Энэ бүс дэх хадгалагдсан үлдэгдлийн ала орлуулалт (Зураг 5C ба D ба SI хавсралт, Зураг S8) нь N3826 нь in vitro NMP9-д nsp9 зайлшгүй шаардлагатай бол N3825A ба E3827A орлуулалт нь NMPylation буурахад хүргэдэг бол M3829A болон P383 орлуулалт нь тийм биш болохыг харуулж байна. .nsp9 NMPylation-д нөлөөлөх нь ойлгомжтой.Хэдийгээр N-терминал Asn (N3825A, N3825S) орлуулах нь эсийн өсгөвөрт nsp9 NMPylation болон вирусын хуулбарлахад зөвхөн дунд зэргийн нөлөө үзүүлдэг (Зураг 5С ба D) N-терминал 3825-NN дипептидээс Asn үлдэгдэл дарааллыг устгадаг. Энэ нь вирусыг үхэлд хүргэдэг нь батлагдсан бөгөөд энэ нь N-төгсгөлд нөгөө үлдэгдлийн өмнө нэг Asn үлдэгдэл, болж өгвөл Asn байх шаардлагатайг харуулж байгаа боловч ижил төстэй үлдэгдлийг хэсэгчлэн орлуулахыг зөвшөөрч болно (Зураг 5B, C, D).3825-NN дипептид, ялангуяа коронавирусын хүрээн дэх хадгалагдсан, зайлшгүй шаардлагатай N3826 үлдэгдэл (SI хавсралт, Зураг S6) нь NiRAN-ийн идэвхтэй хэсэгт nsp9 N-терминусыг зөв холбож, чиглүүлэхийг баталгаажуулдаг гэж бид дүгнэж байна.
Бүх дэд бүлгүүдийн хадгалагдсан цавуугаар Ala (E3827A)-г орлуулах нь in vitro nsp9 NMPylation-ийг хадгалах боловч эсийн өсгөвөрт байгаа вирусыг үхэлд хүргэдэг (Зураг 5C ба D) нь энэ үлдэгдлийн нэмэлт функцийг, тухайлбал, үндсэн харилцан үйлчлэлд (NMPylated эсвэл өөрчлөгдөөгүй) харуулж байна. ) nsp9 N-терминус болон вирусын хуулбарлахад оролцдог бусад хүчин зүйлүүд.Nsp9 мутаци нь nsp9 эсвэл зэргэлдээх nsps (39)-ийн уураг задлах процесст нөлөөлөөгүй (SI Хавсралт, Зураг S9) нь ажиглагдсан хэд хэдэн nsp9 мутацийн үхлийн фенотип нь С протеолитик процесс-терминал pp1a талбайн зохицуулалтгүй байдлаас шалтгаалаагүйг харуулж байна. .
Дээрх өгөгдлүүд нь pp1a/pp1ab дахь nsp8|9-ийн задралын талбайг Mpro-зуучлан эмчилсний дараа nsp9-ийн N-төгсгөлийг UMPyated (эсвэл өөр NMP-ээр хэсэгчлэн өөрчлөх) боломжтойг нотолж байна.Нэмж дурдахад, nsp9-ийн N-төгсгөлийн (коронавирусын гэр бүлийн цорын ганц болон хувиршгүй Asn үлдэгдэл орно) маш сайн хадгалагдаж, энэ судалгаагаар олж авсан урвуу генетикийн өгөгдөл (Зураг 3E ба 5D) нь тайлбарласан nsp9 NMPylation гэж дүгнэхэд хүргэсэн. Биологийн хувьд хамааралтай бөгөөд коронавирусын хуулбарлахад зайлшгүй шаардлагатай.Энэхүү өөрчлөлтийн функциональ үр дагаврыг, жишээлбэл, өмнө нь тайлбарласан (өвөрмөц бус) nsp9 (өөрчлөгдөөгүй хэлбэр) РНХ-тэй холбох үйл ажиллагааны талаар (2628) судлах шаардлагатай хэвээр байна.N-терминал NMPylation нь уураг эсвэл РНХ субстраттай nsp9-ийн харилцан үйлчлэлд эсвэл өөр дөрвөн түвшний угсралт үүсэхэд нөлөөлж болно.Эдгээр нь бүтцийн судалгаанд ажиглагдсан бөгөөд ялангуяа энэ өөрчлөлтийн үед (26- ââ29, 40) байхгүй байсан ч коронавирусын хуулбарлах үйл ажиллагаатай холбоотой болох нь батлагдсан.
Хэдийгээр коронавирусын NiRAN домэйны зорилтот онцлогийг илүү нарийвчлан тодорхойлох шаардлагатай хэвээр байгаа ч бидний мэдээлэл нь коронавирусын NiRAN домэйны уургийн зорилтот онцлог нь маш нарийн байгааг харуулж байна.Нидовирүсийн бүх гэр бүлийн NiRAN домэйн дэх гол идэвхтэй талбайн үлдэгдэл (8, 16) хадгалагдаж байгаа нь эдгээр уургийн хадгалагдсан NMPylator-ийн идэвхийг хүчтэй дэмжиж байгаа боловч энэ домэйны субстратыг холбосон халаасны үлдэгдлийг тодорхойлох нь хадгалалт, хамгаалалтыг тодорхойлоогүй хэвээр байна. , мөн Nidovirales-ийн зорилгын өөр өөр бүлгүүдийн хооронд ялгаатай байж болно.Үүний нэгэн адил бусад үүрлэсэн вирусуудын холбогдох зорилтууд хараахан тогтоогдоогүй байна.Эдгээр нь nsp9 эсвэл бусад уургийн алслагдсан ortologs байж болно, учир нь ерөнхийдөө үүрлэсэн вирусуудад хадгалагддаг таван хуулбарын домэйны гаднах дараалал нь бага хадгалагддаг (8), үүнд Mpro болон NiRAN-ын хоорондох геномын массив, тэдгээрийн дотор nsp9 нь корона вирус.
Нэмж дурдахад, NiRAN домэйн нэмэлт (үүрэн холбоог оруулаад) зорилттой байхыг бид одоогоор үгүйсгэхгүй.Энэ тохиолдолд шинээр гарч ирж буй уургийн NMPylators (NMPylators) (30, 31) дахь бактерийн гомологууд нь "мастер зохицуулагч"-тай юм шиг санагдахыг дурдах нь зүйтэй болов уу?NMP нь эсийн янз бүрийн уургуудыг зохицуулж, тэдгээрийн доод урсгалын үйл ажиллагааг зохицуулах эсвэл арилгахын тулд эсийн стрессийн хариу урвал, исэлдэлтийн гомеостаз зэрэг янз бүрийн биологийн процессуудад үүрэг гүйцэтгэдэг (22, 33).
Энэхүү судалгаагаар (Зураг 2, 4 ба SI Хавсралт, Зураг S3 ба S5) бид nsp12 нь UMP (NMP) хэсгийг nsp9-д нэг (хадгалагдсан) байрлалд шилжүүлсэн бол бусад уурагууд нь өөрчлөгдөөгүй болохыг баталж чадсан. Ашигласан нөхцөлд, сайн тодорхойлсон (сул биш) субстратын өвөрмөц байдлыг дэмждэг.Үүнтэй уялдуулан N-терминал nsp9 NMPylation-тэй харьцуулахад nsp12-ийн өөрийн NMPylation-ийн идэвхжил маш бага, түүнийг илрүүлэхэд ауториографийн өртөлтийн хугацаа илүү урт бөгөөд nsp12-ын концентрацийг 10 дахин нэмэгдүүлэхэд ашигладаг.Нэмж дурдахад, бидний MS шинжилгээ нь nsp12-ийн NMPylation-ийн нотолгоо гаргаж чадаагүй бөгөөд энэ нь NiRAN домэйн өөрөө NMPylation нь (хамгийн сайндаа) хоёрдогч үйл ажиллагаа гэдгийг харуулж байна.Гэсэн хэдий ч бусад судалгаагаар бактерийн NMPylator-ийн өөрөө AMPylation байдал нь бусад уургийн субстрат дээрх NMPylation идэвхийг удирдаж болох тухай урьдчилсан нотолгоог өгсөн гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй (22, 33).Иймээс EAV nsp9 (16) ба коронавирусын nsp12 (энэ судалгаа) -ын мэдээлсэн өөрөө NMPylation үйл ажиллагааны боломжит функциональ нөлөөлөл, түүний дотор C-терминал RdRp домэйны нугалахад санал болгож буй шаперонтой төстэй нөлөөг судлахын тулд илүү их судалгаа хийх шаардлагатай байна. 16) ).
Өмнө нь нидовирусын NiRAN домэйны доод урсгалын боломжит функцүүдийн талаарх хэд хэдэн таамаглалыг авч үзсэн бөгөөд үүнд РНХ лигаза, РНХ-хаалгатай гуанилат трансфераза, уургийн анхдагч үйл ажиллагаа (16) байсан боловч тэдгээрийн аль нь ч боломжит доод урсгалын функцтэй нийцэхгүй байна.Дараахь байрлалд олж авсан мэдээлэл нь нэмэлт таамаглалгүйгээр яг ижил цаг хугацаа юм.Энэхүү судалгаагаар олж авсан өгөгдөл нь NiRAN домэйн нь уургаар үүсгэгдсэн РНХ-ийн нийлэгжилтийг эхлүүлэхэд оролцдог гэдэгтэй хамгийн нийцэж байгаа (гэхдээ нотолж чадахгүй).Өмнө нь NiRAN домэйны функц 5 ??²-РНХ битүүмжлэх эсвэл РНХ холбох урвалд эдгээр болон бусад өгөгдлийн дэмжлэг нөлөөлөхгүй.Тиймээс, жишээлбэл, NiRAN-ийн идэвхтэй хэсэг нь хадгалагдсан Asp-ийг ерөнхий суурь болгон авч үздэг (Pseudomonas syringae SelO дахь D252; HCoV-229E pp1ab-д D4271; SARS-CoV-2 nsp12-д D208) (SI Хавсралт, зураг 2) ).S2) (17, 22, 33), харин ATP-аас хамааралтай РНХ-ийн лигаза ба РНХ-ийн таглах фермент дэх катализ нь өөрчлөгдөөгүй Lys үлдэгдэл агуулсан ковалент фермент-(лизил-N)-NMP завсрын бүтээгдэхүүнээр явагддаг. 41).Нэмж дурдахад, хадгалсан уургийн зорилтот NiRAN-ийн коронавирусын гайхалтай дараалалд суурилсан өвөрмөц байдал, NTP-ийн хамтарсан субстратын сул өвөрмөц чанар (UTP-ийг илүүд үздэг) нь NiRAN-аар дамждаг битүүмжлэх фермент эсвэл РНХ-ийн лигазтай төстэй үйл ажиллагааг эсэргүүцдэг.
Уургаар үүсгэгдсэн РНХ-ийн нийлэгжилтэнд nsp9-UMP (nsp9-NMP) ямар үүрэг гүйцэтгэж болохыг баталгаажуулах, нотлоход маш их нэмэлт ажил шаардлагатай байгаа нь тодорхой боловч өмнө нь мэдээлсэн хэд хэдэн сонирхолтой боловч (одоо хүртэл) тайлангуудыг холбох болно. .Тусгаарлагдсан ажиглалтууд.Жишээлбэл, коронавирусын сөрөг хэлхээний РНХ-ийн төгсгөл нь олиго(U) хэлхээнээс эхэлдэг нь тогтоогдсон (42, 43).Энэхүү ажиглалт нь сөрөг хэлхээтэй РНХ-ийн нийлэгжилтийг nsp9-ийн UMPжуулсан хэлбэрийг поли(А) сүүлтэй (триггер) холбосноор эхэлдэг гэсэн санаатай нийцэж байгаа бөгөөд энэ нь РНХ-тэй холбогдох үйл ажиллагаа ба/эсвэл харилцан үйлчлэлээр дэмжигддэг. өөр RTC уураг.Дараа нь nsp9-ийн өгсөн UMP хэсгийг геномын РНХ-ийн 3??²-поли(А) сүүл эсвэл өөр олиго (A) агуулсан дарааллыг ашиглан nsp7/8/nsp12-зуучлагдсан олигуридилацын "праймер" болгон ашиглаж болно. пикорнавирусын VPg уураг (44)-д зориулсан механизмтай төстэй загвар болж үйлчилдэг.Хэрэв санал нь "норматив бус" байвал яах вэ????(Уургаар өдөөгдсөн) сөрөг хэлхээний РНХ-ийн нийлэгжилтийг эхлүүлсэн нь ажиглалтын холбоосыг бий болгодог бөгөөд энэ нь коронавирусын сөрөг хэлхээний РНХ нь төгсгөлд UMP (UTP-ийн оронд) байгааг харуулж байна (42), энэ нь нуклейн хүчил Дисер нь үл мэдэгдэх уридин өвөрмөц эндонуклеазаар фосфоржуулсан төгсгөлийг задалдаг.Хэрэв энэ нь батлагдсан бол нуклейн хүчлийн гидролизийн идэвхжил нь шинээр гарч ирж буй сөрөг хэлхээний 5 ² төгсгөлөөс nsp9-ийн олигомерик UMPylated хэлбэрийг гаргахад тусална.nsp9-ийн уургийг боловсруулахад гүйцэтгэх үүрэг нь өмнөх урвуу генетикийн судалгаатай нийцэж байгаа бөгөөд nsp9 (болон nsp8) нь коронавирусын геномын 3-р төгсгөлийн ойролцоо хадгалагдсан cis-үйлчилгээтэй РНХ элементтэй маш чухал бөгөөд тусгайлан харилцан үйлчилдэг болохыг харуулсан.45).Энэхүү тайланд дурдсанаар, эдгээр өмнөх ажиглалтуудыг одоо дахин судалж, цаашдын судалгаагаар өргөжүүлэх боломжтой.
Дүгнэж хэлэхэд, бидний өгөгдөл нь N-терминус дээр RdRp-тэй холбогдсон хувийн үүрлэсэн вирусын ферментийн шошгоны тодорхой үйл ажиллагааг тодорхойлсон.Коронавирусын хувьд энэхүү шинээр нээгдсэн NiRAN-зуучлалын UMPylator/NMPylator үйл ажиллагааг Mn2+ болон зэргэлдээх Asn үлдэгдэлд тулгуурлан N-терминалын анхдагч аминтай (бага энергитэй) фосфорамидын холбоо үүсгэхэд ашигладаг.Nsp8|9-ийн задралын талбайд Mpro-зуучлагдсан хуваагдлаар дамжуулан nsp9 зорилтот хэсгийг NMPylation-д ашиглаж болох бөгөөд энэ нь RdRp хүртэл үргэлжилдэг протеаз ба NiRAN домайн хоорондын функциональ холболтыг харуулж байна.NSp12 NiRAN идэвхтэй сайт болон nsp9 зорилтот хэсэгт гол үлдэгдлийг хадгалах, SARS-CoV-2 зэрэг хоёр коронавирусаас олж авсан өгөгдөлтэй хослуулсан нь nsp9 NMPylation нь коронавирус гэдгийг баттай нотолж байна.Боломжит өгөгдөл нь уургаар үүсгэгдсэн РНХ-ийн нийлэгжилтэд NMP9-ийн NMPyated хэлбэрийн онцгой үүрэг нь коронавирус болон бусад үүрлэсэн вирусуудын хувьд боломжийн хувилбар бөгөөд NiRAN нь бусад үл мэдэгдэх уурагуудыг онилж болзошгүй гэсэн дүгнэлтэд хүргэж байна.Вирусыг зохицуулах.Хостын харилцан үйлчлэл.Хэрэв вирусын РНХ-ийн нийлэгжилтэнд уургийн праймерын оролцоо батлагдвал өмнө нь илэрсэн коронавирус ба пикорнавирустай төстэй супер бүлгийн (9) хооронд Mpro/3CLpro болон RdRp домэйнуудын дарааллын хамаарлыг нэмэгдүүлэх болно. 46) ангилалд багтана.
Энэхүү судалгаанд тодорхойлсон үндсэн, сонгомол, консерватив ферментийн үйл ажиллагааг вирусын эсрэг эмийн зорилтот болгон ашиглаж болохыг бидний мэдээлэл харуулж байна.NiRAN-ийн идэвхтэй хэсэгт хадгалагдсан nsp9 N-төгсгөлийг холбоход (болон дараагийн өөрчлөлт) саад учруулж буй нэгдлүүдийг янз бүрийн (дэд) төрлийн халдварын амьтан, хүний коронавирусыг эмчлэхэд тохиромжтой, үр дүнтэй, олон талт вирусын эсрэг эм болгон боловсруулж болно. SARS-CoV-2, Ойрхи Дорнодын амьсгалын замын хам шинжийн коронавирус зэрэг.
Энэхүү судалгаагаар үйлдвэрлэсэн коронавирусын уургийн кодчиллын дарааллыг HCoV-229E-ийн халдвартай Huh-7 эсвэл SARS-CoV-2-ийн халдвартай Vero E6-аас тусгаарласан РНХ ашиглан RT-ПГУ-аар олшруулж, стандарт клончлох процедурыг ашиглан оруулсан.pMAL-c2 (Шинэ Английн биологийн лаборатори) эсвэл pASK3-Ub-CHis6 (47) илэрхийллийн вектор (SI Хавсралт, Хүснэгт S1 ба S2).Нэг кодон орлуулалтыг ПГУ-д суурилсан сайт руу чиглэсэн мутагенезаар нэвтрүүлсэн (48).MBP хайлуулах уураг үйлдвэрлэхийн тулд E. coli TB1 эсийг тохирох pMAL-c2 плазмидын бүтэцтэй (SI хавсралт, Хүснэгт S1) өөрчилсөн.Холимог уургийг амилозын хамаарлын хроматографийн аргаар цэвэршүүлж, Xa фактороор задлав.Дараа нь C-терминал His6 шошготой уургийг өмнө нь тайлбарласны дагуу Ni-immobilized metal affinity хроматографи (Ni-IMAC) ашиглан цэвэршүүлсэн (49).Ubiquitin хайлуулах уураг үйлдвэрлэхийн тулд E. coli TB1 эсүүд зохих pASK3-Ub-CHis6 плазмидын бүтэц (SI Хавсралт, Хүснэгт S1 ба S2) ба pCGI плазмидын ДНХ-ийг кодлодог ubiquitin-ийн өвөрмөц C-терминал гидролаз 1 (Ubp1) -ийг ашигласан.Өөрчлөлт (47).C-терминал His6 шошготой коронавирусын уураг өмнө нь тайлбарласны дагуу цэвэршүүлсэн (50).
HCoV-229E nsp12-His6-ийн өөрөө NMPylation тестийг EAV nsp9 (16)-д тайлбарласны дагуу хийсэн.Товчхондоо, nsp12-His6 (0.5 μM) нь 50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоны хүчил (HEPES)-KOH, рН 8.0, 5 мМ дитиотреитол (DTT), 6 мМ MnCl2, μMff2er агуулдаг. заасан NTP ба 0.17 μM нь [α32-P]NTP (3,000 Ci/ммоль; Хартман Аналитик) 30 °C-т 30 минутын турш таарсан.nsp12-зуучлагдсан nsp9 NMPylation-ийн бусад бүх (стандарт) NMPylation шинжилгээнд урвалын нөхцөлийг дараах байдлаар тохируулна: nsp12-His6 (0.05 µM) ба nsp9-His6 (4 µM) 50 мМ HEPES-KOH (pH 8.0) байх үед. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μM нь NTP-ийг зааж өгсөн ба 0.17 μM нь [α32-P]NTP-тэй таарч байна.30°С-т 10 минутын турш өсгөвөрлөсний дараа урвалын дээжийг SDS-PAGE дээжийн буфер: 62.5 мм трис(гидроксиметил)аминометан HCl (рН 6.8), 100 мм DTT, 2.5% SDS, 10% глицерол, 0.005% бромонтой хольсон. цэнхэр.Уургийг 90 0С-т 5 минут халааж денатурат хийж, 12% SDS-PAGE-ээр салгав.Гель нь бэхлэгдсэн бөгөөд Coomassie Brilliant Blue уусмалаар (40% метанол, 10% цууны хүчил, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250) будаж, өнгийг нь тайлж, 20 цагийн турш фосфоресцент дүрслэлийн дэлгэцэнд байлгана (NMPy-ээс nsp12 илрүүлэх) эсвэл (хамгийн их) 2 цаг (nsp9 NMPylation-ийг үнэлэх).Дэлгэцийг скан хийхэд Typhoon 9200 (GE Healthcare) зураг авагч, дохионы эрчмийг шинжлэхэд ImageJ ашигласан.
MS шинжилгээнд 1 μM nsp12-His6 ба 10 μM nsp9 (гексахистидин шошгогүй) NMPylation шинжилгээнд (SI хавсралт, Хүснэгт S1) ашигласан ба 500 μM UTP болон GTP-ийн нэмэгдсэн концентрацийг ашигласан.Тэдний концентраци болон хүлээгдэж буй уургийн чанараас хамааран MassPrep багана (Ус) бүхий Waters ACQUITY H-Class HPLC системийг 1-10 мкл буферт уургийн уусмалыг онлайнаар давсгүй болгоход ашигласан.Давсгүй уураг нь буфер А (ус/0.05% шоргоолжны хүчил) болон буфер В (ацетонитрил/0.045% шоргоолжны хүчил)-ийн дараах градиентаар дамжин Synapt G2Si масс спектрометрийн (Ус) цахилгаан шүршигч ионы эх үүсвэрт шингэж, баганын температур 60 ° C ба 0.1 мл/мин урсгалын хурд: 2 минутын турш 5% A-аар изократ аргаар шүүж, дараа нь 8 минутын дотор шугаман градиентийг 95% B болгож, 95% B-ийг дахин 4 минут байлгана.
500-аас 5000 м/ц хүртэлх масстай эерэг ионууд илэрсэн.Массын шилжилтийг автоматаар засахын тулд глю-фибринопептид В-ийг 45 секунд тутамд хэмждэг.Үндсэн үзүүлэлтийг хасч, жигдрүүлсний дараа дундаж спектрийг задлахын тулд MaxEnt1 өргөтгөлтэй MassLynx хэрэгслийн програм хангамжийг ашиглана уу.
UMPylated HCoV-229E nsp9-ийг дарааллын түвшний өөрчлөгдсөн трипсин (Серва) нэмж шингээж, 37 ° C-т шөнийн турш өсгөвөрлөсөн.Chromabond C18WP ээрэх багана (хэсгийн дугаар 730522; Macherey-Nagel) нь пептидүүдийг давсгүйжүүлж, баяжуулахад ашигласан.Эцэст нь пептидийг 5% ацетонитрил, 0.1% шоргоолжны хүчил агуулсан 25 мкл усанд уусгав.
Дээжийг MS Orbitrap Velos Pro масс спектрометр (Thermo Scientific) ашиглан шинжилсэн.Дээд зэргийн nanoâ HPLC систем (Dionex), тусгай төгсгөлд суурилуулсан 50 см-ээр тоноглогдсон ??75 μм C18 RP багана нь 2.4 μм соронзон бөмбөлгүүдийгээр савлагдсан (Доктор Альбин Майш High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray эх үүсвэрээр онлайнаар масс спектрометрт холбогдох;6 мкл трипсиний задралын уусмалыг 300 мкм-ийн дотоод диаметр рүү тарина ×??1 см C18 PepMap урьдчилан баяжуулах багана (Thermo Scientific).Уусгагч болгон ус/0.05% шоргоолжны хүчлийг ашиглан дээжийг автоматаар барьж, 6 мкл/мин урсгалын хурдтайгаар давсгүйжүүлсэн.
300 нл/мин урсгалын хурдтайгаар триптик пептидүүдийг салгахад хүрэхийн тулд дараах ус/0.05% шоргоолжны хүчил (уусгагч А) ба 80% ацетонитрил/0.045% шоргоолжны хүчил (уусгагч В) ашигласан: 4% В. 5 минут, дараа нь 30 А шугаман градиент минутын дотор 45% B хүртэл, 5 минутын дотор 95% уусгагч В хүртэл шугаман өсөлт.Хроматографийн баганыг зэвэрдэггүй ган нано ялгаруулагчтай (Proxeon) холбож, 2300 В-ын потенциалыг ашиглан масс спектрометрийн халсан хялгасан судсанд шууд цацруулагчийг шүршинэ. Orbitrap масс анализаторт 60,000 нарийвчлалтай судалгааны сканнер холбогдсон байна. Доод тал нь гурван өгөгдөлтэй MS/MS сканнердсан, 30 секундын турш динамикаар хасагдсан, шугаман ионы мөргөлдөөнөөс үүдэлтэй диссоциаци эсвэл тойрог зам илрүүлэхтэй хослуулсан өндөр энергийн мөргөлдөөний диссоциацийг ашиглан, Нарийвчлал нь 7,500.
Шуудангийн цаг: 2021 оны 8-р сарын 03-ны хооронд